血液Phe濃度在施用所有劑量含量一週後減少至正常含量，其中1E+14及2E+14之劑量導致最低含量。 為了通過連鎖測量靶插入，使用兩套引子及探針，一個用於靶向經緘默改變hPAH有效負荷，以及第二個用於靶向同源臂之外的Pah基因體序列。 分子療法 通過判定由於概率而超出預期之包含有效負荷及基因體序列兩者之液滴比例來測量靶插入，除以所測試的Pah等位基因總數。 爲了判定在PAH基因之基因座每一等位基因的靶插入含量，使用了利用微滴式數字PCR的測定法。 在該測定法中，靶插入藉由測量hPAH轉基因及基因體靶之間的遺傳連鎖來判定。
一種rAAV，其包含： （a）AAV衣殼，其包含AAV衣殼蛋白質；及 （b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。 圖 9A為顯示在以所指示之劑量向ARSA（-/-）小鼠靜脈內投與封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000之後，在腦部中實現之正常hARSA活性之百分比之圖。 圖 9B為顯示在以所指示之劑量靜脈內投與封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000之後，ARSA（-/-）小鼠之大腦中之以每個細胞計的載體基因組之數目之圖。 圖 9C為顯示在給藥後12週之過程中，投與4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000的新生ARSA（-/-）小鼠中之hARSA酶活性水準之圖。 圖 9D為顯示投與4e13 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000的成年ARSA（-/-）小鼠之大腦中之ARSA酶活性水準（經由hARSA轉錄物分析）之圖。 圖 9E為顯示在投與單次靜脈內4e13 分子療法 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每微克基因組DNA計的載體基因組之數目之圖。
因此，本領域中需要經改良之基因療法組成物及方法，其可有效及安全地恢復MLD患者中之ARSA基因功能。 分子療法 異染性白質失養症（MLD）為具有較高的未滿足之醫學需求之致死性溶酶體貯積病。 此神經退化性疾病以三種形式（嬰兒晚期、青少年及成年人）存在且係由於溶酶體酶芳基硫酸酯酶-A（ARSA）不足引起。 ARSA位於稱為溶酶體之細胞結構中，其在溶酶體中有助於分解髓硫脂。 此酶之不足可引起腦部、脊髓及周邊器官中髓硫脂之大量積聚，引起髓鞘之嚴重損傷，髓鞘為神經纖維之主要保護層。
個體可為具有ARSA突變之人類個體、非人類靈長類動物個體（例如食蟹獼猴）或嚙齒動物個體（例如小鼠）。 可使用本文中所揭示之方法治療任何與ARSA基因突變相關之疾病或病症。 本文中所揭示之方法可應用於任何在ARSA基因中具有突變之細胞。 本領域中熟習此項技術者將瞭解，對需要活性內源ARSA之細胞尤其感興趣。 因此，在某些具體實施例中，將該等方法應用於任何損失內源ARSA活性之細胞。
整合動能藉由監測在不同時間點內隨時間推移之血清Phe含量、隨時間推移之載體基因體含量、隨時間推移之PAH轉基因mRNA表達含量及隨時間推移之靶向整合含量來調查。 發現載體基因體含量、PAH轉基因mRNA表達含量及整合頻率隨時間推移而穩定（圖12A-12C）。 圖9J顯示給予指定劑量之封裝於AAVHSC15內之PAH-006m-LP1 12週後所檢測（使用如實例2所描述之NGS方法）到的靶上載體插入頻率。 如同所示，在接收封裝於AAVHSC15衣殼內之PAH-006m-LP1之小鼠中觀察到由NGS所檢測之靶向整合的劑量反應。
在另一態樣中，本發明提供一種用於製備rAAV之封裝系統，其中封裝系統包含：編碼一或多種AAV Rep蛋白之第一核苷酸序列；編碼如本文所描述之衣殼蛋白的第二核苷酸序列；及包含如本文所描述之rAAV之rAAV基因體序列的第三核苷酸序列。 分子療法 在某些實施例中，封裝系統包含了包含有第一核苷酸序列及第二核苷酸序之第一載體，以及包含有第三核苷酸序列之第二載體。 在某些實施例中，封裝系統進一步包含有包含一或多種輔助病毒基因之第四核苷酸序列。 在某些實施例中，第四核苷酸序列包含一或多種來自選自由以下組成之群的病毒的基因：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒及巨細胞病毒。
每組三隻雄性小鼠施用封裝於AAVHSC15衣殼之PAH-006m 1E+14 vg/kg、或製劑緩衝液，以及每週測量血液Phe含量共12週。 在第12週時間點，犧牲小鼠以測量在PAH基因座的靶插入及mRNA表現含量。 在另一態樣中，本發明提供用於重組製備本文所揭示之重組腺相關病毒的封裝系統。
從出生開始用低含量之苯丙胺酸配方的飲食管理大幅度地防止病症之神經性後果的發展。 然而，即使是低蛋白飲食，兒童仍患有發育遲緩，而成人時常患有骨質疏鬆症及缺乏維他命。 苯丙酮尿症是一種自體隱性遺傳疾病，其中大部分個案是由在苯丙胺酸羥化酶基因中突變所造成。 PAH基因編碼肝酶，其在多聚化作用下催化L-苯丙胺酸至L-酪胺酸的羥基化。 PAH活性降低或喪失會導致苯丙胺酸積聚，且其轉化為苯丙酮酸鹽（亦稱苯乙酮）。 此種在苯丙胺酸代謝中之異常損害神經元成熟及髓磷脂的合成，導致智能障礙、癲癇及其他嚴重的醫學問題。
在即將給藥之前以及在給藥後第1、2及4週獲得用於血液學及臨床化學之血液。 在第28及29天之屍檢時，在腦脊髓液（CSF）及血液收集之後，向動物灌注1.0 L低溫生理食鹽水以移除血球。 分子療法 在屍檢時收集腦部、肝臟、脊髓（子宮頸及腰）、子宮頸及腰背根神經節（DRG）、三叉神經節、腎臟、坐骨神經、周邊淋巴結、脾、心臟、肺及睪丸。 如本文中所使用，術語「與ARSA基因突變相關之疾病或病症」係指由ARSA基因之突變引起、由ARSA基因之突變加劇或在遺傳學上與ARSA基因之突變相關之任何疾病或病症。
本申請案含有序列表，其已經以ASCII格式之電子方式提交，且以全文引用之方式併入本文中（該ASCII複本創建於2021年5月24日，名稱為「 HMW-040PC SL.txt」且大小為213,352個位元組）。 來自美國參與此研究的論文第一作者莫里斯（Kevin Morris）表示，此療法對抗所有乙型冠狀病毒皆有效，包括十八年前引發恐慌的嚴重急性呼吸道症候群（SARS）冠狀病毒，及目前肆虐全球的新冠病毒。 事實上，使用極大劑量的維生素是「正確分子療法」治療疾病最重要的武器，這樣的治療極為安全，與使用合成藥物絕不能超過建議量的治療方式是截然不同的。
使用三種對於以下具有特異性之引子執行PCR：i)基因體區域；ii)對整合之等位基因具有特異性的區域；及iii)對野生型等位基因具有特異性的區域。 靶上載體整合頻率經由使用源自經處理動物的肝臟之DNA競爭地擴增野生型及在PAH區域整合的等位基因兩者而測定。 擴增產物之長讀取定序覆蓋了同源臂，其與基因體、整合及載體基因體序列一致。 相鄰的序列也被長讀取序列所涵蓋，以判定所讀取的來源是來自野生型、整合或載體基因體。 包含基因體DNA及經緘默改變hPAH轉基因的連續序列被歸類為整合等位基因，而僅包含基因體DNA但在靶整合位點沒有經緘默改變hPAH轉基因的序列被歸類為野生型等位基因。 整合序列百分比計算為：映射至整合參考之讀取數目除以映射至整合參考之讀取、映射至野生型參考之讀取及映射至載體基因體多聯體之讀取的總數目。
如請求項1至34中任一項之rAAV，其中該5’同源臂核苷酸序列與該第一基因體區域至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。 圖 13A 及 13B顯示為封裝於AAVHSC15之hPAH-hI1C-032-LP1-SD3分別對每ug基因體DNA所檢測到之載體基因體含量及自HuLiv小鼠分離的人類肝細胞中每10 ng總RNA所檢測到的mRNA表達含量的影響的圖。 圖 13C顯示為，依所指定劑量給予封裝於AAVHSC15之hPAH-hI1C-032-LP1-SD3後於不同時間點自HuLiv小鼠分離的人類肝細胞中所檢測到靶上插入頻率的圖。 在以人類設計載體處理之小鼠中，血清Phe含量在施用載體後的一週時間點減少（圖11B）。 對於經處理之第4及10週齡小鼠（第10組及第11組），Phe含量之減少維持經過43週，顯示對治療反應的長期耐久性。 在經處理之2週齡小鼠（第9組），經過30週Phe含量維持在≤360 µM之臨床相對含量。
圖 16為顯示用所指示之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5005處理或用媒劑對照物處理之非人類靈長類動物中之丙胺酸轉胺酶（ALT）含量之圖。 圖 8為顯示在靜脈內（IV）或鞘內（IT）投與封裝於AAVHSC15中之轉移載體pHMI-5000之後，後腦及中腦中之正常人類ARSA酶活性之百分比之圖。 根據表4及5中所闡述之實驗設計向非人類靈長類動物（NHP）投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5005。 在第0天，經由經頭部/隱靜脈進行1-2分鐘緩慢推注靜脈內注射（IV）或直接注射至大池（CM）中來進行投藥。 在每天上午以及在給藥當天在完成給藥之後（15分鐘）及給藥後4小時進行臨床觀測。
來自單一食蟹獼猴及單一人類供體之總數為5E+5的肝細胞以封裝於AAVHSC15衣殼內之1.5E+5 vg/細胞的PAH-032h載體處理。 使用對於人類編輯的等位基因具有特異性之引子及對於非人類靈長類編輯的等位基因具有特異性之引子藉由PCR以評估PAH基因座之編輯。 因此，通過標準稀釋曲線在陽性控制組DNA中判定PCR測量效率。 此種PCR測定法對編輯的等位基因之15複製物之檢測具有較低限制（2.618E-5 amol）。
圖13A及13B顯示在指定劑量下施用封裝於AAVHSC15內之hPAH-hI1C-032-LP1-SD3第4及第12週後，自HuLiv小鼠分離之人類肝細胞所檢測到的載體基因體含量及mRNA含量。 如同所示，隨時間推移長達12週發現人類肝細胞中載體基因體含量（圖13A）及mRNA表達（圖13B）為劑量敏感的且穩定的。 使用利用了相對於輸入基因體DNA靶之編碼序列特異性引子及探針之定量PCR測量載體基因體含量。 經由定量RT-PCR進行表達測量，其使用相對於總RNA的編碼序列特異性引子及探針。
- 此實例提供用於在經載體轉導之細胞（例如人類細胞或小鼠細胞）中的hARSA之表現之人類ARSA轉移載體pHMI-5004。
- 圖 5為顯示在靜脈內投與封裝於AAV9或AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000（在每種情況下以2e13 vg/kg之劑量投與）之後，ARSA（-/-）小鼠之大腦中的以每個經轉導之細胞計的載體基因組之數目之圖。
- 如本文所用，術語「在標準AAV施用條件下」係指轉導在肝細胞消融後移植入小鼠中的人類肝細胞，其中AAV係以每公斤體重1 × 1013載體基因體的劑量靜脈內施用。
- 人類設計載體包含人類同源臂序列且由於序列差異將不會期望通過同源重組整合至小鼠基因體中，因此在這些實驗中人類設計載體僅作爲游離基因的控制組。
髓鞘產生細胞中之髓硫脂積聚引起整個神經系統（包括腦部、脊髓以及連接腦部及脊髓與肌肉及偵測感覺（諸如觸覺、疼痛、熱及聲音）之感覺細胞之神經）中之白質之進行性損壞。 因此，MLD之特徵在於中樞神經系統且接著周邊神經系統之進行性軸突髓鞘脫失。 此引起獲得性功能及/或技能之喪失、低張症、共濟失調、癲癇、失明、聽力喪失及過早地死亡。
如請求項1至36中任一項之rAAV，其中該第一基因體區域係位於第一編輯窗中，以及該第二基因體區域係位於第二編輯窗中。 圖 8A-8C顯示為隨時間推移在PAHenu2小鼠中PAH-006m-LP-1對血液Phe濃度之影響的圖。 圖 8A顯示全數據集，而圖 8B顯示在某時間範圍內具有減少的y軸刻度的數據，以顯示劑量之間差異。 圖 8C顯示在PAHenu2小鼠中PAH-006m-LP-1的靶上整合（藉由次世代定序測量）。 在利用小鼠設計載體治療的小鼠中，血清Phe含量在施用載體一週後降低至正常含量（圖11A）。