在一些具體實施例中，經純化之司美格魯肽分液之pH值為約8.0至約8.5。 人類昇糖素類似胜肽-1 利拉魯肽 (GLP-1)受體協同劑包括艾塞那肽、利拉魯肽、拉糖肽、利司那肽及司美格魯肽。 其中，人類昇糖素類似胜肽-1 利拉魯肽 (GLP-1)之同系物司美格魯肽(商品名胰妥讚)與利拉魯肽(商品名胰妥善)顯示可作為飲食與運動的添加劑，以改進成人第2型糖尿病的血糖控制。
在第三態樣中，本發明提供一用於純化利拉魯肽之方法，本方法包括： 將粗利拉魯肽溶於包含鹵化溶劑之溶液中；以及 將溶液置於RP-HPLC純化系統中，並收集經純化之利拉魯肽分液。 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該流動相D於線性梯度下由體積百分比0-10%被沖提至50-100%。 如申請專利範圍第14項至第16項任一項所述之方法，其中該流動相C包含在水中濃度為5-50mM的銨鹽或磷酸鹽。 如申請專利範圍第11項或第12項所述之方法，其中該流動相B於線性梯度下由體積百分比5-25%被沖提至80-100%。 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該流動相A及該流動相B各包含體積百分比0.1-1%的三氟乙酸。
利拉魯肽: Q1. 使用Saxenda善纖達（瘦瘦筆）注射時，會不會很疼痛？
在某些具體實施例中，步驟中的溶液包括體積百分比5-35%的氟化醇和0.1-1%的氟化酸。 在某些具體實施例中，步驟中的溶液包括體積百分比15-20%的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）和0.1-1%的氟化酸。 在某些具體實施例中，步驟中的溶液包括體積百分比20-30%的2,2,2-三氟乙醇（TFE）和0.1-1%的氟化酸。 在某些具體實施例中，步驟中的溶液包括體積百分比15-20%的1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）和0.1-1%的三氟乙酸。 在某些具體實施例中，步驟中的溶液包括體積百分比20-30%的2,2,2-三氟乙醇（TFE）和0.1-1%的三氟乙酸。
將所取得的溶液裝載於填充C8，10 μm矽膠的RP-HPLC製備管柱中，管柱直徑和長度為8 cm × 12.6 cm，裝載量為27.1 g。 「約」一詞係指一數值範圍，其中包括給定值，對本發明技術領域中具通常知識者而言，該數值範圍與該給定值合理近似。 在某些具體實施例中，「約」一詞係指位於可接受習知測量方法所測得的一個標準差內。 在某些具體實施例中，「約」一詞係指位於該給定值+/- 10%的範圍內。
利拉魯肽: 利拉魯肽
在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為8 cm × 12.6 cm 時，第一次純化的流速為約152 mL/min。 在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為10 mm × 250 mm 時，第一次純化的流速為4至8 mL/min。 在某些具體實施例中，當管柱的直徑和長度為10 mm × 250 mm時，第一次純化的流速為約4.7 mL/min。
在一些具體實施例中，流動相B係以體積百分比約10至95%之線性梯度沖提，其中流動相A為含有0.2%三氟乙酸之水溶液；以及流動相B為含有約0.2%三氟乙酸之乙腈溶液。 在一些具體實施例中，依據梯度表3，流動相B係以體積百分比約10至95%之線性梯度沖提，其中流動相A為含有0.2%三氟乙酸之水溶液；以及流動相B為含有約0.2%三氟乙酸之乙腈溶液。 在一些具體實施例中，依據表1之梯度，流動相B係以體積百分比約10至95%之線性梯度沖提，其中流動相A為含有0.2%三氟乙酸之水溶液；以及流動相B為含有約0.2%三氟乙酸之乙腈溶液。 純化利拉魯肽包含兩階段RP-HPLC純化步驟及一鹽交換步驟，其中pH值於第一次及第二次純化步驟中維持恆定。 具體而言，前述方法於樣品製備步驟中使用一鹵化溶劑，該溶劑具備較佳溶解度，且可提供適合利拉魯肽粗肽於RP-HPLC純化前脫羧的環境。 利拉魯肽 具體實施例 28：如具體實施例 26之方法，其中步驟之溶液包含體積百分比20-30%之2,2,2-三氟乙醇與0.1-1%之氟化酸。
利拉魯肽: 利拉魯肽
具體實施例 36：如具體實施例 34之方法，其中磷酸鹽係選自於由磷酸三鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸三鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸三銨、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨及其混合物組成之群組。 具體實施例 21：一用於純化利拉魯肽之方法，其包含： 將粗利拉魯肽溶於包含鹵化溶劑之溶液中；以及 將溶液置於RP-HPLC純化系統中，並收集經純化之利拉魯肽分液。 第一與第二次純化之流速取決於RP-HPLC製備管柱之尺寸。 在一些具體實施例中，當管柱之直徑與長度為5 cm x 22 cm至8 cm x 12.6 cm時，第一次純化之流速為約50至200 mL/min。 在一些具體實施例中，當管柱之直徑與長度為5 cm x 22 cm至8 cm x 12.6 cm時，第一次純化之流速為約100至160 mL/min。
在一些具體實施例中，步驟之溶液包括體積百分比15-20%之1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇與0.1-0.3%之三氟乙酸。 在一些具體實施例中，步驟之溶液包括體積百分比20-30%之2,2,2-三氟乙醇與0.1-0.3%之三氟乙酸。 在一些具體實施例中，步驟之溶液包括體積百分比約17%之1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇與約0.2%之三氟乙酸。
利拉魯肽: Q1. 使用Saxenda善纖達（瘦瘦筆）注射時，會不會很疼痛？
如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該第一次RP-HPLC純化使用流動相A，其包含三氟乙酸和水，以及流動相B，其包含三氟乙酸和乙腈。 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟中的RP-HPLC純化系統包含第一次RP-HPLC純化和第二次RP-HPLC純化；該第一次RP-HPLC純化於pH小於7時進行；該第二次RP-HPLC純化於pH大於7時進行。 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟中的鹵化溶劑選自由氟化酸、氟化醇、氯化溶劑及其混合物組成的群組。
在一些具體實施例中，第一次RP-HPLC純化係於pH值小於3之下進行；以及第二次RP-HPLC純化係於pH值大於約7之下進行。 在一些具體實施例中，第一次RP-HPLC純化係於pH值小於3之下進行；以及第二次RP-HPLC純化係於pH值大於約7.5之下進行。 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該第一次RP-HPLC純化於pH小於3時進行；且該第二次RP-HPLC純化於pH大於7.5時進行。 一種純化利拉魯肽的方法，包含：將利拉魯肽粗肽溶於包含鹵化溶劑的溶液中；及將該溶液置於RP-HPLC純化系統中純化，並收集經純化的利拉魯肽組份。 本發明內容已藉由前文的具體實施例及實例詳述，以使概念清晰易懂，但所屬技術領域具通常知識者將了解，可在所附請求項界定的範圍內對本發明進行特定變化和修飾。 此外，本文所提供的各參考文獻係以全文方式併入本文中，相當於分別引用及併入各篇參考文獻。
利拉魯肽: Q1. 使用Saxenda善纖達（瘦瘦筆）注射時，會不會很疼痛？
美國專利號9,422,330 B2揭示了用於純化分別以合成方式製造之粗司美格魯肽及以酵母菌發酵製造之粗利拉魯肽的方法。 管柱係首先以25-48%乙醇(10 mmol/kg檸檬酸鹽緩衝液、125 mmol/kg氯化鈉，pH 4.5)之線性梯度洗滌，隨後在pH 4.5下以48%乙醇進行等度洗滌。 隨後，藉由pH 4.5至pH 7.4之線性pH梯度，沖提出標靶司美格魯肽，其中流動相包括10 mmol/kg檸檬酸鹽緩衝液、125 mmol/kg氯化鈉及48%乙醇。 如美國專利號9,422,330之實施例6所述，以水稀釋粗利拉魯肽並進行RP-HPLC純化，其中固定相為十八烷基二甲基矽基二氧化矽，其起初以流動相(20 mM Tris緩衝液/20%乙醇，pH 7.5)進行平衡。
本申請案與本文提供的參考文獻內容牴觸時，應以本申請案內容為主。 由此可取得pH值約7.5-8.0的鹽交換利拉魯肽，再將所取得的利拉魯肽凍乾。 以流動相C稀釋含純度92.17%利拉魯肽的組份，再將前述組份裝載於填充C8/10 μm矽膠的RP-HPLC管柱中。 用33%的銨調整純度90.58%利拉魯肽的組份至pH值8.5，並以20 mM、pH 8.5之甲酸銨稀釋，再將前述組份裝載於填充C8，10 μm矽膠的RP-HPLC管柱中。 管柱直徑和長度為8 cm × 12.6 cm，裝載量為6.2 g。
利拉魯肽: 利拉魯肽
以流動相C稀釋含有92.17%純度之利拉魯肽分液，隨後裝載至RP-HPLC管柱(其填充C8之10 μm二氧化矽，且直徑與長度為4.6 mm x 100 mm)上。 將990.3毫克之粗利拉魯肽溶於11.22 mL之六氟異丙醇溶液(含有17% HFIP之0.2% TFA溶液)中。 將19.5克之粗利拉魯肽溶於238 mL之六氟異丙醇溶液(含有17% HFIP之0.2% TFA溶液)中。 以33%之銨將含有90.58%純度之利拉魯肽分液調整至pH值為8.5，並以pH值為8.5之20 mM甲酸銨稀釋，隨後裝載至RP-HPLC管柱(其填充C8之10 μm二氧化矽，且直徑與長度為8 cm x 12.6 cm)上。 具體實施例 30：如具體實施例 29之方法，其中第一次RP-HPLC純化係於pH值小於3之下進行；以及第二次RP-HPLC純化係於pH值大於約7.5之下進行。 在一些具體實施例中，磷酸鹽係選自於由磷酸三鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸三鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸三銨、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨及其混合物組成之群組。
- 在某些具體實施例中，流動相D進一步包括體積百分比10%至60%的銨鹽水溶液。
- 在某些具體實施例中，流動相C包括20 mM的磷酸鹽水溶液。
- 在一些具體實施例中，第二次RP-HPLC純化使用包括磷酸鹽水溶液之流動相C且流動相D為乙腈。
- 在一些具體實施例中，第二次RP-HPLC純化使用包括銨鹽或磷酸鹽之流動相C及包括乙腈之流動相D。
- 在一些具體實施例中，磷酸鹽係選自於由磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀及其混合物組成之群組。
- 在一些具體實施例中，第二次RP-HPLC純化使用包括銨鹽之流動相C及包括乙腈之流動相D。
- 在一些具體實施例中，步驟之溶液包括體積百分比約17%之1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇與約0.2%之三氟乙酸。
在某些具體實施例中，流動相B於線性梯度下由體積百分比5-15%被沖提至90-100%，其中流動相A為水中含0.2%三氟乙酸的溶液；流動相B為乙腈中含約0.2%三氟乙酸的溶液。 在某些具體實施例中，流動相B於線性梯度下由體積百分比約10%被沖提至95%，其中流動相A為水中含0.2%三氟乙酸的溶液；流動相B為乙腈中含約0.2%三氟乙酸的溶液。 在某些具體實施例中，流動相B於表1所示線性梯度下由體積百分比約10%被沖提至95%，其中流動相A為水中含0.2%三氟乙酸的溶液；流動相B為乙腈中含約0.2%三氟乙酸的溶液。 美國專利第9,422,330 B2號揭露一種純化透過酵母菌發酵製備的利拉魯肽粗肽的方法。 如美國專利第9,422,330號的實例6所述，以水稀釋利拉魯肽粗肽並以RP-HPLC純化，其中固定相為十八烷基-二甲基矽烷基矽膠，該矽膠最初以流動相20 mM 三乙醇胺緩衝液/20%乙醇平衡至pH 利拉魯肽 7.5。 首先使用該平衡溶液洗滌管柱，再以線性梯度沖提，接著以等位梯度及流動相沖提，流動相包括乙醇和20 mM檸檬酸鹽緩衝液、pH為 5.1。
利拉魯肽: Q1. 使用Saxenda善纖達（瘦瘦筆）注射時，會不會很疼痛？
具體實施例 29：如具體實施例 21之方法，其中步驟之RP-HPLC純化系統包含第一次RP-HPLC純化與第二次RP-HPLC純化；第一次RP-HPLC純化係於pH值小於7之下進行；以及第二次RP-HPLC純化係於pH值大於7之下進行。 具體實施例 利拉魯肽 22：如具體實施例 21之方法，其中步驟之鹵化溶劑係選自於由氟化酸、氟化醇、氯化溶劑及其混合物組成之群組。 在一些具體實施例中，步驟係藉由施加流動相E1及隨後的流動相E2而進行，從而提供鹽交換之利拉魯肽分液。 在一些具體實施例中，流動相D進一步包括20 mM甲酸銨之水溶液。 在一些具體實施例中，流動相D進一步包括20 mM甲酸銨之水溶液；以及pH值為約8.5。 在一些具體實施例中，流動相D包括20 mM甲酸銨之水溶液與乙腈；以及pH值為約8.5，其中水溶液與乙腈之體積比率為50與50。
在一些具體實施例中，流動相D進一步包括體積百分比10至60%之量的銨鹽水溶液。 在一些具體實施例中，流動相D進一步包括體積百分比20至60%、30至60%、40至60%或約50%之量的銨鹽水溶液。 在一些具體實施例中，流動相D進一步包括體積百分比約50%之量的銨鹽水溶液。 司美格魯肽或利拉魯肽係經由兩次連續的RP-HPLC純化及隨後的鹽交換步驟純化，其中pH值在第一與第二次純化步驟中保持恆定。 特別的是，本方法在樣本製備步驟中使用鹵化溶劑，其提供粗司美格魯肽或粗利拉魯肽在RP-HPLC純化前之更佳溶解度及適合脫羧反應的環境。
利拉魯肽: 利拉魯肽
在一些具體實施例中，流動相C包括含有濃度為5至50 mM之銨鹽或磷酸鹽的水。 在一些具體實施例中，流動相C包括含有濃度為10至40 mM之銨鹽或磷酸鹽的水。 在一些具體實施例中，流動相C包括含有濃度為10至30 mM、15至25 mM或約20 mM之銨鹽或磷酸鹽的水。
利拉魯肽: Q1. 使用Saxenda善纖達（瘦瘦筆）注射時，會不會很疼痛？
在某些具體實施例中，流動相A及流動相B各包括體積百分比0.1-0.3%的三氟乙酸。 在某些具體實施例中，流動相A及流動相B各包括體積百分比約0.2%的三氟乙酸。 利拉魯肽 在某些具體實施例中，流動相A為水中含0.2%三氟乙酸的溶液；流動相B為乙腈中含約0.2%三氟乙酸的溶液。 如請求項6之方法，其中步驟之溶液包含體積百分比15-20%之1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇與0.1-1%之氟化酸。 將189.0 mg之粗司美格魯肽溶於3.15 mL之三氟乙醇溶液(含有25% TFE之0.2%三氟乙酸溶液)中。
利拉魯肽: 利拉魯肽
在一些具體實施例中，流動相C包括15 mM甲酸銨之水溶液。 在一些具體實施例中，流動相C包括15 mM甲酸銨之水溶液；以及pH值為約8.3。 在一些具體實施例中，流動相C包括乙腈與15 mM甲酸銨之水溶液；以及pH值為約8.3，其中水溶液與乙腈之體積比率為95與5。