采用 10% FBS的 IMDM培养基培养 Chla+B16细胞。 用 51Cr标记的 Chla+B16细胞做 靶细胞， 下述操作如实施例 1的相关表述。 经过以上五个步骤后， 一个脱氧核苷酸就被连到 CPG的核苷酸上， 同样再用三氯 乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸 5’」经基上的保护基团 DMT后， 重复以上的活化、连接、 封闭、 氧化过程即可得到一 DNA片段粗品。 最后对其进行切割、 脱保护基 (一般对八、 C碱基采用苯甲酰基保护； G碱基用异丁酰基保护； T碱基不必保护； 亚磷酸用腈乙基 保护）、 纯化（常用的有 HAP, PAGE, HPLC, C18, 0PC等方法）、 定量等合成后处理即 可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。 、 权利要求 4所述的疫苗组合物， 其中所述的修饰包括非硫代修饰、 硫代修饰、 部 分硫代修饰、稀有碱基修饰、 甲基化修饰、巯基、 Aminolinker C6、或 Thiol-C6 S-S 用于与其他物质偶联所应用的修饰方式。 本领域的普通技术人员可以了解， 包含一个或多个上式序列的人工合成的单链脱 氧核苷酸均可以用于实现本发明的目的。
、 按照权利要求 6或 7所述的疫苗组合物， 其中所述的抗原肽选自多表位丙型肝炎 病毒核心抗原肽， 沙眼衣原体主要外膜蛋白表位抗原肽， 人前列腺特异性抗原肽， MUC1抗原肽或 HER-2抗原肽。 上述结核杆菌热休克蛋白 65 和 HER- 2抗原肽融合蛋白 (HSP- HER- 2)、 前腺癌 人工合成的单链脱氧核苷酸（Oligo) (同实施例 3)、转染 HER- 2抗原肽基因的 B16细 胞 （HER-2+B16细胞）。 、 一种生产权利要求 1所述的疫苗组合物的方法， 包括将权利要求 2至 5任一项所 述的单链脱氧核苷酸与抗原或抗原组合物混合。 本发明所述的人工合成的单链脱氧核苷酸还包括单链脱氧核苷酸中碱基上各个 基团的修饰， 其中所述的修饰包括非硫代修饰、 硫代修饰、 部分硫代修饰、 稀有碱基 修饰 （dl， dU等）、 甲基化修饰、 巯基、 Aminol inker C6s 或 Thiol- C6 S- S等用于与 其他物质偶联所应用的修饰方式。
、 权利要求 1至 8任一项所述的疫苗组合物在治疗病毒感染、 细菌感染、 寄生 虫感染、 变态反应或癌症中的应用。 、 权利要求 1至 8任一项所述的疫苗组合物在制备用于治疗病毒感染、 细菌感 染、 寄生虫感染、 变态反应或癌症的疫苗中的应用。 采用 前腺癌 10% FBS的 IMDM培养基培养转染 HER- 2抗原肽基因的 B16细胞 （HER 细胞）。
按常规方法取小鼠脾细胞或淋巴结细胞， 以下操作 如实施例 1的相关表述。 采用 10% FBS的 IMDM培养基培养 HCV+B16细胞。 用 “Cr标记 HCV+B16细胞（在 37°C， 5% C02条件下培养 1小时）。 用含 10% FBS的 IMDM洗涤细胞， 共三次。 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱， 形成亚磷酰胺 四唑活性中间体 (其 3′ -端已被活化， 但 5′ -端仍受 DMT保护）， 此中间体将与 GpG上 的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到 CpG上已脱保护基的核苷酸时， 将与其 5′ 前腺癌 -羟基发 生亲合反应， 缩合并脱去四唑， 此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。 DNA合成采用固相亚磷酰胺三酯法合成 DNA片段， 此方法具有髙效、 快速偶联等 优点， 已在 DNA化学合成中广泛使用。
本发明的另一目的在于提供一种生产疫苗组合物的方法， 包括将有效量的上述人 工合成的单链脱氧核苷酸与有效量的抗原或抗原组合物混合。 优选将有效量的人工合 成的单链脱氧核苷酸与有效量的由分枝杆菌热休克蛋白 65和抗原肽形成的复合物或 融合蛋白相混合’。 本发明的另一方面提供了一种增强抗原或抗原组合物免疫剌激作用的方法， 其是 将人工合成的单链脱氧核苷酸与抗原或抗原组合物联合使用。 上述结核杆菌热休克蛋白 65和人前列腺特异性抗原 抗原肽融合蛋白 （HSP-PSA)、 人工合成的单链脱氧核苷酸 （Oligo) (同实施例 3)、 转染 PSA抗原肽基因的 B16细胞 （PSA+B16细胞）。 上述结核杆菌热休克蛋白 65和多表位 HCV核心抗原融合蛋白（HSP- HCV)、 人工合成的单链脱氧核苷酸（Oligo) (同实施例 3)、转染 HCV核心抗原多表位抗原肽 基因的 B16细胞 （HC B16细胞）。
、 权利要求 14所述的方法， 其中所述的热休克蛋白为结核杆菌热休克蛋白 65。 、 权利要求 14或 15所述的方法， 其中所述的抗原肽选自多表位丙型肝炎病毒 核心抗原肽，沙眼衣原体主要外膜蛋白表位抗原肽，人前列腺特异性抗原肽， MUC1 抗原肽或 HER-2抗原肽。 前腺癌 、 一种增强抗原或抗原组合物免疫刺激作用的方法， 包括将权利要求 2至 5任 一项所述的单链脱氧核苷酸与抗原或抗原组合物联合应用。 、 权利要求 10所述的方法， 其中所述的热休克蛋白为结核杆菌热休克蛋白 65。 、 权利要求 10或 11所述的方法， 其中所述的抗原肽选自多表位丙型肝炎病毒 核心抗原肽，沙眼衣原体主要外膜蛋白表位抗原肽，人前列腺特异性抗原肽, 前腺癌 MUC1 抗原肽或 HER-2抗原肽。
用 51Cr标记 HER-2+B16细胞 （培养 1小时， 37°C, 5% C02)。 用含 10% FBS的 IMDM洗涤细胞， 共三次。 用含 10% FBS 的 IMDM培养基重悬细胞， 加入含 10% ConA及 HSP- HER-2 (200μβ ) 的 IMDM培养基刺激小鼠脾细胞。 用含 10% FBS的 IMDM培养基重悬细胞，加入含 10% ConA及 HSP- MUC1 (200 g/ral ) 的 IMDM培养基刺激小鼠脾细胞。 采用含 10% FBS的 IMDM培养基培养转染 PSA抗原肽基因的 B16细胞 前腺癌 （PSA+B16细 胞）。 用 61Cr标记 PSA+B16细胞， （培养 1小时， 37X, 5% C02)。 用含 10% FBS的 IMDM 洗涤细胞， 共三次。
、 权利要求 2或 3所述的疫苗组合物， 其中所述的人工合成的单链脱氧核苷酸在其 碱基上各个基团被修饰。 分枝杆菌热休克蛋白 65能够携带与其融合的或结合的或偶联的抗原肽进入 MHC I 类抗原提呈途径， 激活抗原肽特异性的细胞毒性 T淋巴细胞， 杀伤表达抗原肽的肿瘤 细胞。 、 权利要求 1 所述的疫苗组合物， 其中所述的抗原或抗原组合物为热休克蛋白与抗 原肽融合所形成的融合蛋白。 细胞毒实验 将 5lCr标记的 Chla+B16细胞于 10% FBS的 IMDM培养基中加入到 96孔培养板的 孔中， 下述操作和细胞毒的计算如实施例 1的相关表述。
于第 1 , 14 和 21 天分别给各组小鼠注射生理盐水、 HSP- PSA、 Oligo 和 HSP-PSA+Oli go o 于小鼠四肢靠近淋巴结处四点皮下注射 （SC；)。 用三氯乙酸脱去连结在 CpG 上的核苷酸的保护基团 DMT (二甲氧基三苯甲基）， 获得游离的 5′ -羟基端， 以供下一步缩合反应。 下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例， 进一步详细地描述本发明。
- 、 权利要求 1至 8任一项所述的疫苗组合物在治疗病毒感染、 细菌感染、 寄生 虫感染、 变态反应或癌症中的应用。
- 本发明所述的人工合成的单链脱氧核苷酸还包括单链脱氧核苷酸中碱基上各个 基团的修饰， 其中所述的修饰包括非硫代修饰、 硫代修饰、 部分硫代修饰、 稀有碱基 修饰 （dl， dU等）、 甲基化修饰、 巯基、 Aminol inker C6s 或 Thiol- C6 S- S等用于与 其他物质偶联所应用的修饰方式。
- 下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例， 进一步详细地描述本发明。
- 优选将有效量的人工合 成的单链脱氧核苷酸与有效量的由分枝杆菌热休克蛋白 65和抗原肽形成的复合物或 融合蛋白相混合’。
- 采用 10% FBS的 IMDM培养基培养 HCV+B16细胞。
- 、 权利要求 1至 8任一项所述的疫苗组合物在制备用于治疗病毒感染、 细菌感 染、 寄生虫感染、 变态反应或癌症的疫苗中的应用。
、 权利要求 17所述的用途， 其中所述的病毒感染为丙型肝炎病毒感染或由该病 毒感染引起的相关疾病。 采用 10% FBS的 IMDM培养基培养 MUC1+B16细胞。 用 51Cr标记 PSA+B16细胞 （培 养 1小时， 37°C， 5% C02) o 用含 10% FBS的 IMDM洗涤细胞， 共三次。
本 领域的普通技术人员应理解， 这些实施例只是为了举例说明本发明， 而非以任何方式 限制本发明的范围。
在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法， 例 如合成采用固相亚磷酰胺三酯法、 ELBA采用间接法。 、 权利要求 17所述的用途， 前腺癌 其中所述的癌症为前列腺癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 肺 癌、 胃癌、 子宫内膜癌、 唾液腺癌、 腺癌、 结肠和直肠癌、 非小细胞肺癌或肺腺 癌。 于第 1， 14 和 21 天分别给小鼠注射生理盐水、 HSP- HER- 2、 Oligo 和 前腺癌 HSP- HER-2+01igo。 于第 28天接种 HER- 2+B16细胞 （1 X 105/只）， 注射部位是小鼠右 后背部皮下。 沙眼衣原体 （Chlamydia Trachomatis, CT) 是不运动的专营细胞内寄生的微生 物， 可在人类引起沙眼、 包涵体性结膜炎、 泌尿生殖系统疾病、 性病淋巴肉芽肿、 子 宫内膜炎、 输卵管炎、 盆腔炎、 输卵管性不孕及输卵管异位妊娠。