其他醫藥上可接受載體可為彼等揭示於「Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995」文獻者。 「胜肽擬物」乙詞意指一胜肽或非胜肽，其抑制能誘導KIRREL3、CNTN4、及/或CD351活性之KIRREL3、CNTN4、及CD351蛋白質之一或多者的結合結構域。 「shRNA (短髮夾型RNA)」乙詞意指單股RNA，包含一莖部分，其經由氫鍵形成雙股部分，以及一環部分。
舉例而言，本發明之活性成分可與適用之賦形劑及/或佐劑混合，之後加工成顆粒混合物，以得到口服之片劑或糖衣片劑。 任意地，可加入崩散劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸、或海藻酸鈉。 副甲狀腺癌 此外，本發明之醫藥組合物可進一步包含抗凝劑、潤滑劑、潤濕劑、芳香劑、乳化劑、及防腐劑等。 儘管過去幾年來，在癌症病因學的了解及治療癌症的方法等方面取得了進展，但其仍然是全世界死亡的主因。
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如請求項6所述之用於增強免疫的醫藥組合物，其中該抑制劑抑制受試者之KIRREL3、CNTN4、及CD351之一或多者的表現或活性，以增加T細胞介導之免疫反應量。 如請求項1所述之用於治療或預防癌症的醫藥組合物，其中該抑制劑為化合物、胜肽、胜肽擬物、融合蛋白、抗體、或適配體，其特異地結合至KIRREL3、CNTN4、及CD351蛋白質之一或多者。 一種用於治療或預防癌症的醫藥組合物，其包含一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑。
雖然許多惡性腫瘤都有抗癌療法，但這些治療通常無法完全控制這類惡性腫瘤，或對所有病患皆無效。 通過手術可切除受影響的組織，通過放射線療法可減少實體瘤大小，或使用化學療法可快速殺死癌細胞。 接著，依序經由離心與靜置沈澱等步驟處理該些細胞以得到一第一沈澱物S104。 隨後利用上述配方(即介白素15號與介白素12號)回溶第一沈澱物S105。 後續，將以第三圖與第四圖進一步詳細說明本發明所提供之培養毒殺型樹突細胞的方法。 其中，第三圖與第四圖均顯示本發明一實施例之培養毒殺型樹突細胞的方法流程圖。
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在本發明之一實施例中，其中於靜置第一合適時間或上述靜置第二合適時間的步驟後，更包含下列步驟：分離出一毒殺型樹突細胞群組。 其中上述分離出之毒殺型樹突細胞群組內的細胞數量為人類血液檢體中篩選出之毒殺型樹突細胞數量的200至400倍。 而上述分離出毒殺型樹突細胞群組的步驟係藉由一流式細胞檢測技術或相關技藝之替代技術來完成。
口服投予之載體可包括，例如，乳糖、澱粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等。 非口服投予之載體可包括，例如，水、合適之油類、生理鹽液、葡萄糖水溶液、乙二醇類等。 醫藥上可接受安定劑可包括，例如，抗氧化劑，如硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、或抗壞血酸。 醫藥上可接受防腐劑可包括，例如，氯化烷基二甲基苄基銨、對羥苄酸甲酯或對羥苄酸丙酯(methyl- or propyl-paraben)、氯丁醇等。
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其由蛋白質，如切丁酶，加工轉化成siRNA，並進行與siRNA相同的功能。 副甲狀腺癌 「反義核酸」乙詞意指DNAs或RNAs含有互補於特定mRNA或其片段或衍生物之序列的核酸序列，其與mRNA互補序列結合或雜交，並抑制mRNA轉譯成蛋白質。 「CD351 (分化集群351)」乙詞意指一Fc受體，其以高親和力結合至IgA與IgM，且亦稱作「Fcα/μR」。 據報導，在小鼠中，該受體表現在巨噬細胞、濾泡樹突細胞、邊緣區與濾泡B細胞、及腎小管上皮細胞。 據報導，在人體中，其表現在腸固有層細胞、潘氏細胞、扁桃體濾泡樹突細胞、活化型巨噬細胞、及一些類型之前胚中心IgD+/CD38+ B細胞。 「CNTN4 (接觸蛋白-4)」乙詞意指由CNTN4基因編碼之蛋白質，其隸屬免疫球蛋白超家族。
將數目2×106個細胞的實施例1.1製備的CD4+ T細胞與CD8+ T細胞加入之96孔培養盤各孔中，其體積為200 μL，之後培養。 CD4+ T細胞與CD8+ T細胞以40 μL之MACS緩衝液再懸浮，其中50 mL試管中之細胞數目為1×107個細胞。 將10 μL之抗CD4與抗CD8生物素抗體分別加入試管中，之後保存在冰箱中5分鐘。
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減少之量亦可指KIRREL3、CNTN4、及CD351之各減少量或KIRREL3、CNTN4、及CD351之單獨減少量的總和。 未以候選抗癌劑處理之組別可為癌細胞，其中不添加物質，或處理除了一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑以外的任何物質如抗癌劑。 副甲狀腺癌 接著，請參考第七圖，第七圖顯示CytoDC培養天數及細胞數量的結果。 也就是說，上述在體外經由本發明所提供之配方及方法所培養的毒殺型樹突細胞群，其數量為人類血液檢體中篩選出之之毒殺型樹突細胞數量的200至400倍。
至於，配方中所使用的介白素15號與介白素12號的濃度與培養方法均已描述如前文，在此不再贅述。 在本發明之一實施例中，其中於上述靜置第一合適時間後，更包含下列步驟：首先，收集未附著的細胞，該些細胞經處理後得到一第一沈澱物。 欲達成本發明之目的，本發明之一態樣係提供一種用於治療或預防癌症的醫藥組合物，其包含一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑以作為活性成分，以及一種治療或預防癌症的方法，其係向有需求之受試者投予一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑。
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在本發明之一實施例中，其中上述配方更包含有效量之另一細胞激素，且上述另一細胞激素為介白素12號。 較佳地，介白素15號的濃度大於1ng/mL，更進一步，介白素15號的濃度為10 ng/mL。 抗原呈現細胞的功能是攝取、加工、處理外源性抗原並將加工後抗原呈現給T淋巴細胞，誘導T淋巴細胞進行增殖進而分化成效應細胞，產生免疫反應，以辨識並抵抗感染甚至癌症細 胞。 樹突細胞(Dendritic cells，DCs)是目前所知的人體內功能最強大的抗原呈現細胞，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。 DC的最大特點是能夠顯著刺激初始T細胞進行增殖，而其他的抗原呈現細胞，如巨噬細胞、B細胞僅能刺激已活化的或記憶性T細胞。
- 然而，必須說明的是，在一較佳實施例中，上述配方雖更可包含介白素12號，但僅包含有介白素15號的配方已可達到良好之培養效果，不僅如此，此配方一定要具有介白素15號，加入介白素12號是可更進一步加強其放大培養效果。
- 請參考第一圖至第二B圖，第一圖顯示健康者與癌症患者在週邊血中毒殺型樹突細胞含量百分比對照圖，第二A圖顯示本發明一實施例中藉流式細胞儀分析癌症患者週邊血的結果，第二B圖顯示本發明一實施例中藉流式細胞儀分析健康者週邊血的結果。
- 據此，本發明所提供之培養毒殺型樹突細胞的配方係包含細胞激素，且此處所指的細胞激素可為單獨使用有效量之介白素15號，或同時使用有效量之介白素15號與介白素12號，本發明並不欲以任一實施例為限。
- 接著，加入10% FBS RPMI1640、移液、及離心以移除上清液。
- 首先，第六A至六C圖顯示本發明一實施例中藉流式細胞儀檢測毒殺型樹突細胞在培養前、培養第三天與培養第七天的結果。
本領域技術人員將理解到，或者能使用不超過常規之實驗，確定本文所述之本發明特定具體實施例的許多等同物。 本實施例旨在確認，當以KIRREL3、CNTN4、或CD351抑制劑中和KIRREL3、CNTN4、或CD351時，是否抑制小鼠腫瘤生長。 下表5為未處理對照組與三個阻斷CD351之中和抗體之第一組至第三組，且下表6為未處理對照組與三個減量CD351之siRNAs之第四組至第六組。 下表3為未處理對照組與用五個阻斷CNTN4之中和抗體之第一組至第五組，且下表4為未處理對照組與三個減量CNTN4之siRNAs之第六組至第八組。 下表1為未處理對照組與用四個阻斷KIRREL3之中和抗體之第一組至第四組，且下表2為未處理對照組與用三個減量KIRREL3之siRNAs之第五組至第七組。
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請參考第一圖至第二B圖，第一圖顯示健康者與癌症患者在週邊血中毒殺型樹突細胞含量百分比對照圖，第二A圖顯示本發明一實施例中藉流式細胞儀分析癌症患者週邊血的結果，第二B圖顯示本發明一實施例中藉流式細胞儀分析健康者週邊血的結果。 如第一圖所示，在癌症患者的週邊血中毒殺型樹突細胞的含量百分比明顯低於健康者。 另外，如第二A圖所示，請見右上角處，癌症患者所提供的週邊血中毒殺型細胞群組10內細胞的含量只有百分之0.0367，而如第二B圖所示，同樣請見右上角處，在健康者所提供的週邊血中毒殺型細胞群組10內細胞的含量為百分之0.436，明顯高於癌症患者。 另外，本發明所揭示的培養方法中的多個分離或篩選步驟均藉由一流式細胞檢測技術(即流式細胞儀)來完成，並適合使用各一或多種流式細胞儀來利用不同群組的細胞擁有不同的細胞表面標記物區分篩選出目標細胞群組。 流式細胞儀能夠以遠遠超過相關技藝任何其他單細胞分析技術之速度實施單細胞分析，相比於使用其他替代技術能夠較快速地分析統計學上有意義之數量的細胞，但本發明並不欲以此為限。 較佳地，在一個實施例中，使用帶有熟習此項技術者習知之任一適宜試樣製備自動裝置或液體處理器的流式細胞儀。
- 足以說明，本發明提供的培養配方及方法可以放大毒殺型樹突細胞，不只原本的毒殺型樹突細胞會增生更可趨化自然殺手細胞轉變成毒殺型樹突細胞。
- 抗體分子之功能性片段意指具有至少其抗原結合功能之片段，且可包括但不侷限於，Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv等。
- 如第八圖A至第十一圖D、第十三圖A至第十六圖D、及第十八圖A至第二十一圖D所示，當以抗體或siRNAs中和KIRREL3、CNTN4、及CD351之一或多者時，在結腸癌、乳癌、胃癌、及白血病亦觀察到增加PBMC細胞毒性的結果。
- 利用本領域習知之方法，口服投予製劑可製成粉末、顆粒、片劑、丸劑、糖衣丸劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等形式。
將肺癌細胞株A549、結腸癌細胞株HCT-116、乳癌細胞株MDA-MB-231、胃癌細胞株MKN-74、及白血病細胞株U937分別與1 μL之CFSE (羧基螢光素琥珀醯亞胺基酯)混合，之後保存在37°C下3分鐘。 以30 mL之FACS緩衝液加入所得物、移液、及離心以移除上清液。 接著，加入10% FBS RPMI1640、移液、及離心以移除上清液。 之後，以10 mL之10% FBS RPMI1640混合所得物，並計數細胞數目。 將數目2×106個細胞的實施例1.1製備之CD4+ T細胞與CD8+ T細胞加入96孔培養盤各孔中，其體積為200 μL，之後培養。 將數目2×106個細胞的實施例1.1製備的CD4+ T細胞與CD8+ T細胞加入96孔培養盤各孔中，其體積為200 μL，之後培養。
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測定KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之T細胞活性抑制程度的方法可包括但不侷限於，本領域常規習知之任何方法，如RT-PCR、西方墨點法、ELISA、放射線免疫試驗、放射線免疫擴散法、歐式免疫擴散法、火箭免疫電泳法、免疫組織化學法、免疫沉澱法、完全固定試驗、或FACS。 舉例而言，其可用於有預防、治療、或改進與免疫缺陷、免疫功能下降、免疫系統損傷、免疫功能受損等相關疾病需求之受試者。 當醫藥組合物投予有需求之受試者時，其可全部或部分減少受試者之KIRREL3、CNTN4、及CD351之一或多者的表現或活性，以增加T細胞介導之免疫反應量。 非經口投予可包括但不侷限於，靜脈注射、肌肉注射、動脈注射、骨髓注射、硬膜內注射、經皮、皮下、腹腔、鼻內、腸內、局部、舌下、直腸投予等。 副甲狀腺癌 可由本發明之醫藥組合物治療或預防的癌症包括但不侷限於，胃癌、肺癌、肝癌、結腸直腸癌、結腸癌、小腸癌、胰腺癌、腦癌、骨癌、黑色素瘤、乳癌、硬化性腺病、子宮癌、子宮頸癌、頭頸癌、食道癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎癌、肉瘤，前列腺癌、尿道癌、膀胱癌、血癌、白血病、淋巴瘤、纖維腺瘤等。 「siRNA (小型干擾性RNA)」乙詞意指短的雙鏈RNA，其能通過切割特定mRNA而誘導RNAi (RNA干擾)。
隨後，將30 μL之MACS緩衝液，其中細胞數目為1×107個細胞，加入所得物中，且將20 μL之抗生物素微珠加入及混合。 接著，利用LS管柱分開CD4+ T細胞與CD8+ T細胞，並計數。 「核糖核酸酵素」乙詞意指一RNA分子具有類似酵素之功能，其辨識特定鹼基序列並將其切斷。 核糖核酸酵素包含一特異性結合至標的訊息RNA股之互補鹼基序列的區域，以及一切割標的RNA的區域。 將製備之CD4+ T細胞和CD8+ T細胞與1 μL之CFSE (羧基螢光素琥珀醯亞胺基酯)混合，其中細胞數目為2×106個細胞，並在37°C下保存3分鐘。
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據報導，其為多醣磷脂肌醇錨定之神經元膜蛋白，作用為細胞黏附分子，並參與神經系統發育過程中的軸突連接形成。 上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本發明之專利範圍中。 名詞定義 除非有其他定義，所有在此所用的技術及科學詞彙，如同作為本發明所屬技術領域中具有一般技藝者一般性地了解具有相同意義。 在此指稱的所有專利、申請案、公開申請案及其他應用，以及基因庫登錄號皆完整以參考文獻被整合起來。
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若以磁珠分選技術為例來說明，則步驟S1004包含下列步驟：首先，加入接有生物素的抗體與週邊血單核細胞群組反應。 此時，T細胞與B細胞因被抗體與磁珠抓住，通過管柱時會被磁場吸住而留在管柱內，因而獲得去除T細胞與B細胞的週邊血單核細胞群組。 較佳地，上述接有生物素的抗體包含anti-CD3與anti-CD19。 較佳地，上述第一合適時間係指將介白素15號與週邊血單核細胞群組均置入培養基後放置一段時間使其開始進行細胞擴增。 在本發明之一實施例中，上述配方更包含有效量之另一細胞激素，且上述另一細胞激素所使用的是介白素12號。