如實施例B1至B19中任一者之方法，其進一步包含將該等iPSC離體分化為所欲細胞類型之細胞。 如實施例B1至B20中任一者之方法，其中所生產之該等iPSC對仙台病毒載體呈陰性。 如實施例B1至B20中任一者之方法，其中所生產之該等iPSC係衍生自γδ T細胞。 如實施例B1至B20中任一者之方法，其中所生產之該等iPSC具有TRG及TRD基因座之重排基因；且其中可選地所生產之該等iPSC具有Vγ9及Vδ2基因重排。
本文中亦提供「醫藥組成物」，其包含根據本文中所述之方法生產的iPSC或自其分化之細胞、及一或多種醫藥上可接受之載劑。 在一具體實施例中，所生產之iPSC或自其分化之細胞係以治療有效量存在。 在一具體實施例中，所生產之iPSC或自其分化之細胞係以疾病預防有效量存在。 醫藥組成物可根據本文中所提供之方法及用途使用。 因此，例如，可向對象投予醫藥組成物以實施本文中所提供之治療或預防方法及用途。
在一些實施例中，如果在該期間後比起如果細胞未與試劑接觸有多上至少2、5、或10倍的經重編程細胞或主要包含經重編程細胞之群落，便將該試劑識別為會重編程細胞之試劑。 本文中所提供之iPSC可用於獲得任何所欲的經分化細胞類型。 此類經分化人類細胞之治療用途是無與倫比的。
將細胞在液態氮中急速冷凍並儲存在-80℃下以供未來使用。 將一小瓶的冷凍iPSC（來自基於滋養細胞或無滋養細胞之培養）在37℃水浴中快速解凍。 將小瓶內容物逐滴添加至50 mL錐形管中，試管含有25 mL的StemFit Basic 2.0培養基（針對基於滋養細胞之培養）或含有10 µM ROCK抑制劑之mTeSR培養基（針對無滋養細胞之培養）。 重要的是要確保細胞係逐滴添加，因為將細胞突然添加至培養基中將會造成滲透性休克。
媒劑可含有其他醫藥上可接受之賦形劑以修改或維持醫藥組成物之pH、滲透性、黏度、或穩定性。 在某些實施例中，經單離iPSC群的基因組係穩定的且無染色體損失。 在一個實施例中，經單離iPSC群的基因組穩定性係藉由核型分析判定。 在某些實施例中，重編程因子係選自由下列所組成之群組：Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、及Lin28。 本揭露之經單離細胞群可衍生自哺乳動物（較佳地人類），但包括且不限於非人類靈長類、鼠（即，小鼠及大鼠）、犬科動物、貓科動物、馬科動物、牛類、綿羊類、豬類、山羊類等。
在培養期結束時，藉由以一個連續動作倒轉含有試管之磁鐵來收集含有經富集細胞懸浮液之培養基。 在多個試管的情境下，在試管置於磁鐵座上時自試管收集上清液（藉由1 mL吸量管手動進行），且不擾動已結合之磁性粒子。 為了產生γδ T細胞衍生iPSC，將來自健康個體之全PBMC與唑來膦酸單水合物、介白素-2、及介白素-15 (Zol 副甲狀腺荷爾蒙 + IL-2 + IL-15)培養不同的期間（3天、8天、及13天）。 為了找出自經Zol刺激之PBMC衍生iPSC之理想時間點，自第3天、第8天、或第13天PBMC培養物富集細胞-細胞團塊（ 圖 1，上排）。
多能性特性之存在指示體細胞已重編程為多能狀態。 如本文中所使用，「重編程」係指改變或反轉體細胞之分化狀態的程序。 重編程涵蓋將體細胞（例如，T細胞）之分化狀態完全反轉為多能狀態。 重編程亦涵蓋將體細胞之分化狀態部分反轉為使細胞更容易在經受額外操作（諸如本文中所述者）時完全重編程為多能狀態之狀態。 此類接觸可導致細胞表現特定基因，而此表現會促成重編程。 在本發明之某些實施例中，體細胞之重編程會造成體細胞處於多能及類ES狀態。
視需要將額外MEF培養基添加至單細胞懸浮液中以進行繼代培養。 在培養期後，添加1.5 mL的EasySep緩衝劑以加滿含有細胞之試管，藉由將細胞溫和上下混合來將其再懸浮。 藉由將細胞再懸浮於純RPMI（無FBS、或1x Pen/Strep）培養基中來將細胞洗滌一次，然後以1500 rpm離心沉降5 min。 將細胞沉澱物再懸浮於1 mL的EasySep緩衝劑(cat # 20144, STEMCELL Technologies)中，並藉由血球計來計數細胞。 本揭露之iPSC可用作為體外分化模型，尤其是用於研究涉及早期發育調控之基因。 使用iPSC之經分化細胞組織及器官可用於藥物研究中。
在某些實施例中，第一段時間係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20天。 如本文中所使用，用語「經單離」或類似者當用於指稱細胞時，其意欲意指細胞實質上不含至少一種當在自然中發現所指稱之細胞時會有的組分。 該用語包括自當在細胞自然環境中發現細胞時會有的一些或所有組分中移出之細胞。 該用語亦包括自當在非自然發生環境中發現細胞時會有的至少一種、一些、或所有組分中移出之細胞。 因此，經單離細胞係與當在自然中發現其時或當其係在非自然發生環境中生長、儲存、或生存時會有的其他物質部分或完全分離。 經單離細胞之具體實例包括部分純的細胞、實質上純的細胞、及培養於非自然發生之培養基中的細胞。
肽是相對短之多肽，一般長度係在約2與60個胺基酸之間。 本文中所使用之多肽一般含有胺基酸，諸如蛋白質中最常見的20種L-胺基酸。 然而，可使用所屬技術領域中已知之其他胺基酸及/或胺基酸類似物。 多肽中之一或多個胺基酸可經修飾，例如藉由添加化學實體，諸如碳水化合物基團、磷酸酯基團、脂肪酸基團、用於接合、官能化之連接子等。 仍將具有與其共價或非共價地相關聯之非多肽部份的多肽視為是「多肽」。
- 如實施例C1或C2之經單離iPSC群，其中該經單離iPSC群對仙台病毒載體呈陰性。
- 如實施例A21之方法，其中在步驟中經轉導之該等γδ T細胞係於單層的滋養層存在下培養。
- 如實施例B1至B12中任一者之方法，其中在步驟中該等γδ T細胞之至少一部分經活化為Vγ9δ2+ γδ T細胞。
- 例如，胚胎幹細胞係多能幹細胞的一種類型，其能夠自三種胚層（外胚層、中胚層、及內胚層）之各者形成細胞。
- 在某些實施例中，經單離細胞群係終末分化細胞。
- 在一個實施例中，用於該等方法中之體細胞僅包含一個連接至第一可選擇標記之內源多能性基因，且進行選擇步驟以針對第一可選擇標記之表現進行選擇。
- 如實施例B8之方法，其中在該活化培養物中培養後，該細胞群包含少於90%、少於80%、少於70%、少於60%、少於50%、少於45%、少於40%、少於35%、或少於30% γδ T細胞。
繼代間隔取決於iPSC群落之生長，其可能隨供體而有所變化。 觀察到大量的經分化細胞，直到前四次繼代結束。 用1 mL吸量管將孔中存在之全部TrypLE試劑吸出。
T淋巴球亦可分化自幹細胞、定型造血內皮、CD34+細胞、HSC（造血幹細胞及前驅細胞）、造血多潛能前驅細胞、或T細胞前驅細胞。 在某些實施例中，對象患有造血系統之過度增生性病症或癌症。 在一些實施例中，本文提供一種組成物，其包含經功能性增強之衍生性免疫細胞的經單離群或亞群，該等細胞已分化自根據本文中所提供之方法生產的iPSC。 副甲狀腺荷爾蒙 在一些實施例中，iPSC包含一或多種靶向基因編輯，其可保留於iPSC衍生免疫細胞中，其中經基因工程改造之iPSC及其衍生性細胞係適用於基於細胞之過繼性療法。 在一個實施例中，經基因工程改造之免疫細胞的經單離群或亞群包含iPSC衍生前T細胞(pro-T cell)或T細胞。 在一個實施例中，經基因工程改造之免疫細胞的經單離群或亞群包含iPSC衍生前NK細胞或NK細胞。
在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至95% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至90% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至85% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至80% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至75% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至70% γδ T細胞。
受損的群落可能要更久（7至10天）才會回復。 培養基需要每24小時更換為新鮮培養基，直到iPSC完全回復。 經幅照MEF係自ATCC以冷凍小瓶(cat # SCRC-1040.1, ATCC)獲得且依ATCC所述解凍。
在某些實施例中，經單離細胞群係終末分化細胞。 在某些實施例中，經單離細胞群係終末分化T細胞。 在某些實施例中，經單離細胞群係終末分化PBMC細胞。 在某些實施例中，經單離細胞群係終末分化γδ T細胞。 在一些實施例中，經單離細胞群可係周邊血液單核細胞、周邊血液白血球、腫瘤浸潤淋巴球、或其組合。 在一些實施例中，經單離細胞群係周邊血液單核細胞。
如實施例B5之方法，其中該細胞群係在該活化培養物中培養至多3天。 如實施例B5之方法，其中該細胞群係在該活化培養物中培養3天。 如實施例B8之方法，其中在該活化培養物中培養後，該細胞群包含少於90%、少於80%、少於70%、少於60%、少於50%、少於45%、少於40%、少於35%、或少於30% γδ T細胞。
如實施例C1至C3中任一者之經單離iPSC群，其中該經單離iPSC群具有TRG及TRD基因座之重排基因；且其中可選地該經單離iPSC群具有Vγ9及Vδ2基因重排。 如實施例C1至C3中任一者之經單離iPSC群，其中該經單離iPSC群並非衍生自αβ T細胞。 如實施例C1至C3中任一者之經單離iPSC群，其中該經單離iPSC群不會生產來自TCRA及TCRB基因座之PCR產物。 如實施例C1至C7中任一者之經單離iPSC群，其中該經單離iPSC群的基因組係穩定的且無染色體損失。 如實施例C8之經單離iPSC群，其中該經單離iPSC群的基因組穩定性係藉由核型分析判定。 如實施例C1至C9中任一者之經單離iPSC群，其中該經單離iPSC群在過繼後可生長並維持於無滋養細胞之培養基中。
在24小時培養後，將含有ROCK抑制劑之培養基更換為無ROCK抑制劑但有bFGF之新鮮培養基，雖然即使在整個培養期間持續使用ROCK抑制劑，仍未觀察到實質差異。 將經再懸浮之iPSC塊狀物接種至6孔盤中，盤係針對基於滋養細胞及無滋養細胞之培養分別用經幅照MEF預先接種（如第7.2.4節中所述）或用玻連蛋白預先塗佈（如第7.2.1節中所述）。 在培養期結束時，將盤自自培養箱中取出並輕輕傾斜。
所得之細胞在本文中係稱為經重編程之多能體細胞或誘導性多能幹細胞。 在一些實施例中，重編程亦涵蓋將體細胞之分化狀態部分反轉為多潛能狀態。 在又另一態樣中，本文提供一種經單離誘導性多能幹細胞群，其包含多能細胞，其中該等多能細胞包含用於表現一或多種重編程因子的構件，且/或其中該等多能細胞包含用於編碼TRG及TRD基因之重排的構件。 在又另一態樣中，本文提供一種生產誘導性多能幹細胞之方法，其包含：用於執行富集且/或活化該經單離細胞群中之γδ T細胞的功能之步驟；及用於執行將該等γδ T細胞重編程為多能狀態的功能之步驟。 在另一態樣中，本文提供一種根據本文中所提供之方法生產的誘導性多能幹細胞。 在又另一態樣中，本文提供一種經單離誘導性多能幹細胞群，其中該經單離iPSC群包含多能細胞，其中該等多能細胞表現一或多種重編程因子，且/或其中該等多能細胞包含編碼TRG及TRD基因之重排的核苷酸序列。
- 將細胞-細胞團塊（或母細胞）用編碼OCT3/4、SOX2、KLF4、及c-Myc重編程因子之仙台病毒載體轉導。
- 經預調理培養基含有許多媒介物質，包括由培養於培養基中之滋養細胞分泌的生長因子及細胞介素。
- 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養2至4小時。
- 仍將具有與其共價或非共價地相關聯之非多肽部份的多肽視為是「多肽」。
在一些實施例中，經重編程體細胞之功能檢定可藉由將其引入囊胚中進行，以判定細胞是否能夠產生所有細胞類型。 如果經重編程細胞能夠形成身體之幾種細胞類型，則其為多潛能的；如果經重編程細胞能夠形成身體之所有細胞類型（包括生殖細胞），則其為多能的。 副甲狀腺荷爾蒙 在一些實施例中，可選擇標記賦予表現其之細胞增生及/或存活優勢，此係相對於不表現其之細胞或以顯著較低之水平表現其之細胞。
代表性FACS圖中之數字顯示在用Zol + IL-2 + IL-15刺激PBMC的第3天（左列）、第8天（中列）、及第13天（右列）時，TCR γδ及αβ T細胞在全PBMC中之頻率（上排）及TCRVγ9 +細胞在γδ T細胞中之頻率（下排）。 〔 圖2A 〕 至 〔 圖2B 〕顯示衍生自用Zol + IL-2 + IL-15刺激3天之PBMC培養物的iPSC群落之顯微鏡觀察。 圖 2A顯示代表性顯微鏡影像，其顯示在MEF滋養層上呈圓形群落之iPSC，該等群落具有緊密且平滑的邊界及緊實的細胞內部邊界。 背景中的細長細胞係經絲裂黴素C處理之MEF滋養層。
在某些實施例中，第一段時間係12至72小時。 在某些實施例中，第一段時間係12至60小時。 在某些實施例中，第一段時間係12至48小時。 在某些實施例中，第一段時間係12至36小時。 在某些實施例中，第一段時間係12至24小時。 在某些實施例中，第一段時間係8至16小時。
可治療或預防之疾病、病症、或病況的實例包括神經、內分泌、結構性、骨骼、血管、泌尿、消化、皮膚、血液、免疫、自體免疫、發炎、內分泌、腎、膀胱、心血管、癌症、循環、消化、造血、及肌肉疾病、病症、及病況。 此外，經重編程細胞可用於重建性應用，諸如用於修復或替換組織或器官。 這些參考文獻例示了已報導之用於自胚胎或類幹細胞獲得經分化細胞的方法。 這些參考文獻及尤其是其中關於用於分化胚胎幹細胞之方法的揭露係以引用方式全文併入本文中。 四環素誘導性啟動子係回應於抗生素之誘導性啟動子的實例。 參見Gossen et al., 2003。
例如，可將所討論之序列選殖至載體中、或以其他方式與一或多種額外核酸重組。 如本文中所使用，用語「多能」係指細胞形成所有身體或細胞體（即，胚體）譜系的能力。 例如，胚胎幹細胞係多能幹細胞的一種類型，其能夠自三種胚層（外胚層、中胚層、及內胚層）之各者形成細胞。 多能性是一連串的發育潛能，範圍從無法產生完整器官的非完全或部分多能細胞（例如，上胚層幹細胞或EpiSC）到能夠產生完整器官的更原始、更多能細胞（例如，胚胎幹細胞）。 在某些實施例中，該方法進一步包含向對象投予經分化之細胞。
相比之下，與反轉錄病毒系統相關聯之困難應藉由使用本揭露之iPSC（其係類ES細胞）而消除。 使用已知方法將所欲基因/突變引入ES細胞中，可將iPSC基因工程改造，並將所得之經工程改造細胞分化為所欲細胞類型，例如造血細胞、神經細胞、胰臟細胞、軟骨細胞等。 在一些實施例中，本發明之經重編程體細胞係類ES細胞，因而可根據已知用於分化ES細胞之方法進行誘導以分化，從而獲得所欲細胞類型。 副甲狀腺荷爾蒙 例如，iPSC可藉由在分化培養基中且在提供細胞分化之條件下培養此類細胞而被誘導，以分化為造血幹細胞、肌肉細胞、心肌細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿道細胞等。
在室溫下將一小瓶的玻連蛋白(cat # A14700, Gibco)（在0.5 mg/mL之儲備液濃度下）解凍。 將60 µL玻連蛋白等分試樣製備於聚丙烯試管中。 這些等分試樣係立即使用或冷凍在-80℃下。 在5 mL聚苯乙烯圓底試管中，將沉降細胞團塊之細胞密度調整至1 mL的EasySep緩衝劑中有50 × 10 6個細胞。 將50 µL的生物素化雞尾酒試劑添加至經再懸浮細胞，將其混合並在室溫下培養15分鐘。