在第三十三態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：40中所闡述之核酸序列之構築體103 bGH polyA。 在第三十二態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：39中所闡述之核酸序列之構築體103AT 2×MG bGH polyA。 在第三十一態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：38中所闡述之核酸序列之構築體103AT 2×MG。 在第三十態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：37中所闡述之核酸序列之構築體103AT。 在第二十九態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：36中所闡述之核酸序列之構築體103反向。 在第二十七態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：35中所闡述之核酸序列之構築體103。
- 在一些實施例中，步驟a)還包含對人類富潛能幹細胞進行基因修飾以減少MHC I類及MHC II類人類白血球抗原之表現。
- 術語「以可操作方式連接」或「可操作地連接」關於兩個或更多個組件(諸如序列元件)之並接可互換使用，其中該等組件經配置以使得兩個組件均正常地起作用，且允許該等組件中之至少一者可介導施加於其他組件中之至少一者上之功能之可能性。
- 測定神經細胞是否逃避免疫識別之方法包括但不限於IFN-γ Elispot分析、小神經膠質細胞殺滅分析、細胞植入動物模型、細胞介素釋放分析、ELISA、使用生物發光成像之殺滅分析或鉻釋放分析或Xcelligence分析、混合淋巴細胞反應、免疫螢光分析等。
- 提供一種自幹細胞活體外分化之室管膜細胞，該室管膜細胞表現外源性CD24多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該室管膜細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。
- 如請求項1至15中任一項之方法，其中該神經細胞係選自由以下組成之群組：腦內皮細胞、神經元、室管膜細胞、星狀細胞、小神經膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、許旺細胞、其先驅細胞及其前驅細胞。
在一些實施例中，致耐受性因子係選自由以下組成之群組：CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重鏈、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、IL-10、IL-35、FASL、Serpinb9、CCL21、CCL22及Mfge8。 在一些實施例中，致耐受性因子係選自由以下組成之群組：DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1-抑制因子及IL-35。 在一些實施例中，致耐受性因子係選自由以下組成之群組：HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1-抑制因子及IL-35。 在一些實施例中，細胞包含調節MHC I及/或MHC II之表現的一或多個靶向多核苷酸序列之基因體修飾。 在一些態樣中，使用基因編輯系統修飾一或多種靶向多核苷酸序列。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
在另一實施例中，本發明提供本發明之AAV載體或本發明之重組AAV病毒粒子中的任一者用於製備供治療A型血友病用之藥物之用途。 在一態樣中，藥物包含有效治療A型血友病之量的一定量表現人類FVIII之AAV載體或重組AAV FVIII病毒粒子。 分子治療 本發明亦提供本發明之用途中的任一者，其中在投予藥物之後，測定個體之血清中不存在或存在抗AAV衣殼抗體。
在第十三態樣中，本發明之重組AAV載體包含SEQ ID NO：21中所闡述之核酸序列之構築體100ATG短polyA 2× μ-球蛋白增強子。 在第十二態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID 分子治療 NO：20中所 闡述之核酸序列之構築體2× SerpinA hAAT ATG FVIII 2× μ-球蛋白增強子。 特定言之，AAV載體之選殖容量由於病毒之DNA包裝容量而受限。 在實踐中，達至約5.0kb之AAV基因組似乎完全包裝(即呈全長)至AAV病毒粒子中。 在AAV載體中之核酸基因組必須具有兩個約145鹼基之AAV反向末端重複序列之要求下，AAV載體之DNA包裝容量使得最大約4.4kb之蛋白編碼序列可經衣殼化。 如請求項115至122中任一項之經分離神經細胞，其中該神經細胞在活體外展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
替代地，經分化DA細胞在含於此類遞送裝置中時可嵌入於支撐基質或支架中。 在一些實施例中，神經細胞在向個體投與時逃避免疫識別及反應。 在一些實施例中，該等細胞逃避巨噬細胞、小神經膠質細胞及NK細胞之殺滅。
- [圖5]描繪移植至健康免疫功能不全SCID-灰棕色小鼠腦部之紋狀體中的野生型小鼠iPSC衍生之內皮細胞的生物發光成像。
- 如請求項131至137中任一項之方法，其中在該患者經歷繼發於該神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期存活。
- 在一些實施例中，一或兩種核糖核酸(例如引導RNA)與目標多核苷酸序列之同一股上之序列互補及/或雜交。
- 如請求項115至121中任一項之經分離神經細胞，其中該神經細胞在移植至患者之中樞或周邊神經系統中時逃避免疫識別。
- 本領域中熟習此項技術者將容易瞭解，待在任何特定細胞中改變之所期望目標多核苷酸序列可對應於基因體序列之表現與病症相關或以其他方式促進病原體進入細胞中之任何基因體序列。
- 本文提供自幹細胞活體外分化之多巴胺神經元，其中該多巴胺神經元表現外源性CD24多肽，其中該多巴胺神經元具有降低表現量之B2M及CIITA，且其中該多巴胺神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。
因此，由於其關於哺乳動物細胞，此等術語可在本文中互換使用。 通常，「載體構築體」、「表現載體」及「基因轉移載體」意謂能夠引導相關基因之表現且可將基因序列轉移至目標細胞之任何核酸構築體。 將載體或構築體引入至細胞中之方法為本領域中熟習此項技術者所已知，且包括但不限於脂質介導之轉移(亦即脂質體，包括中性及陽離子型脂質)、電穿孔、直接注射、細胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沈澱、DEAE-聚葡萄糖介導之轉移及病毒載體介導之轉移。 用於治療神經病症及病況之低免疫原性神經細胞 本發明技術係關於衍生自幹細胞之神經細胞及其治療神經病症及病況之用途。 此外，本發明技術利用自其他非神經細胞類型產生神經細胞類型之方法，該等非神經細胞類型包括但不限於富潛能幹細胞、誘導性富潛能幹細胞及其類似物。 在本發明研究中，包含圖2A之Proto1 FVIII-SQ載體(SEQ ID NO：1)之重組FVIII AAV病毒粒子將藉由單次靜脈內劑量傳遞至人類患者。
分子治療: 核酸医薬
如請求項10之用途，其中所述藥物包含約1E12 vg/kg至約1E14 vg/kg重組AAV FVIII病毒。 患者四經繼續之觀測時段用濃度介於5毫克/天至40毫克/天範圍內的皮質類固醇預防性地治療。 患者二中量測之ALT含量不在28週觀察期期間的任何點增加至超過基線1.5倍或更大，且因此未起始皮質類固醇治療。 將測定基線(亦即在FVIII載體投予之前)丙胺酸轉胺酶濃度且1.5倍或大於1.5倍之投予後ALT升高將觸發治療性皮質類固醇使用。 患者亦可用皮質類固醇預防性地(亦即在FVIII載體投予之前)治療以保護免受肝毒性。 向Rag2-/-x FVIII-/-小鼠投予AAV5-FVIII-SQ導致給藥後8週之失血量及出血時間之劑量依賴性減小。
在一些實施例中，核酸包含如本文所描述之經修飾mRNA(例如合成經修飾mRNA)。 在一些實施例中，神經細胞展現減少表現之MHC I類及/或II類人類白血球抗原。 在一些情況下，MHC I類及/或II類人類白血球抗原之表現與未經修飾或野生型神經細胞相比減少。
分子治療: Taxes and tax credits
出於本發明之目的，「基因」包括編碼基因產物之DNA區，以及調節基因產物之產生的所有DNA區，無論此類調節序列是否鄰近於編碼序列及/或經轉錄之序列。 因此，基因包括(但不一定限於)啟動子序列、終止子、轉譯調節序列(諸如核糖體結合位點及內部核糖體入口位點)、強化子、緘默子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質連接位點及基因座控制區。 細胞之低免疫原性可藉由評價細胞之免疫原性，諸如細胞引發後天性及先天性免疫反應之能力來測定。
在進一步增加B域及a3域缺失FVIII之表現的嘗試中，34鹼基人類ApoE/C1增強子之第二複本以正向或反向插入Proto 5載體中。 長度為4934個鹼基且具有呈正向之內含子ApoE/C1增強子之所得Proto 6載體以示意性形式顯示於圖3C中，且序列闡述於SEQ ID NO：7中。 由於人類AAT啟動子遠端X區先前未顯示在內含子中之轉錄起始位點下游起作用，Proto 2S載體中之此調節元件藉由與內含子中之增強子之第一複本呈相同方向之34鹼基人類ApoE/C1增強子之第二複本置換。 長度為4985個鹼基之所得Proto 3S載體以示意性形式顯示於圖2D中，且序列闡述於SEQ ID NO：4中。 在進一步增加Proto 1S載體中之FVIII SQ變異體之表現的另一嘗試中，合成內含子序列併入34鹼基人類ApoE/C1增強子及32鹼基人類AAT啟動子遠端X區，其自人類AAT啟動子上游之其位置移動。
分子治療: 疫苗安全
本發明提供在昆蟲或哺乳動物細胞中產生重組AAV之材料及方法。 在一些實施例中，病毒構築體進一步包含啟動子及啟動子下游之限制位點以允許插入編碼一或多種所關注的蛋白之聚核苷酸，其中啟動子及限制位點位於5′ AAV ITR下游及3′ AAV ITR上游。 在一些實施例中，病毒構築體進一步包含在限制位點下游及3′ AAV ITR上游之轉錄後調節元件。 在一些實 施例中，病毒構築體進一步包含插入限制位點且與啟動子可操作地連接之聚核苷酸，其中聚核苷酸包含所關注的蛋白之編碼區。 如熟習此項技術者應瞭解，揭示於本申請案中之AAV載體中的任一者可作為病毒構築體用於方法中以產生重組AAV。 產生具有強力啟動子之過大AAV載體以增加B域及a3域缺失FVIII之表現，且此等構築體藉由經修飾增強子及/或啟動子序列產生。
在許多實施例中，在該患者經歷繼發於該神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期功能。 在一些實施例中，該神經細胞群在該患者之血腦障壁之破壞後展現出長期存活。 在許多實施例中，該神經細胞群在該患者之血腦障壁之該破壞後展現出長期功能。 在特定實施例中，該移植包含將該神經細胞群注射至該患者中。 在許多實施例中，該神經細胞群在投與後在該患者中存活及/或發揮功能至少一個月、兩個月、三個月、四個月或更長時間。
分子治療: 接種疫苗
在一些實施例中，低免疫原性細胞逃避MHC錯配同種異體接受體中之免疫排斥。 在一些情況下，由低免疫原性幹細胞產生之分化細胞在投與(例如移植(transplant/grafted))至MHC錯配同種異體接受體時逃避免疫排斥。 在一些實施例中，低免疫原性細胞受到保護而免於T細胞介導之後天性免疫排斥及/或先天性免疫細胞排斥。 分子治療 在一些實施例中，與未經修飾之人類神經細胞或未藉由步驟a)進行基因修飾之神經元細胞相比，步驟b)或c)中之該等人類神經細胞具有減少之MHC I類人類白血球抗原及/或MHC II類人類白血球抗原的表現。
在其他實施例中，DA神經元用於治療或改善神經精神病症之一或多種症狀，諸如注意力缺失過動症、妥瑞氏症候群、精神分裂症、精神病及抑鬱症。 在又其他實施例中，使用DA神經元治療DA神經元受損之患者。 在一些實施例中，DA神經元分化之特徵在於自發節律性動作電位，及在注入去極化電流後具有峰值頻率調適之高頻率動作電位。 所產生多巴胺之含量係藉由量測動作電位在其已達到其最大幅度之一半之點處的寬度(尖峰半最大寬度)而計算。 多巴胺神經元(亦稱為多巴胺能神經元)包括神經元細胞，其表現酪胺酸羥化酶，亦即用於多巴胺合成之限速酶。 分子治療 在一些實施例中，多巴胺神經元分泌神經傳遞質多巴胺，且幾乎沒有或沒有多巴胺羥化酶之表現。
分子治療: 核酸医薬
表現構築體可存在於細胞中游離基因體(諸如質體)上，或表現構築體可插入染色體中。 在特定實施例中，表現載體包括允許選擇經轉化宿主細胞之可選標記基因。 某些實施例包括包含可操作地連接於至少一種調節序列之編碼變異多肽之核苷酸序列的表現載體。 用於本文中之調節序列包括啟動子、強化子及其他表現控制元件。 在某些實施例中，表現載體針對待轉化之宿主細胞之選擇、欲表現之特定變異多肽、載體之複本數、控制該複本數之能力或由載體編碼之任何其他蛋白質，諸如抗生素標記之表現進行設計。
在一些實施例中，本文所描述之改變或修飾引起目標或經選定多肽序列之表現減少。 如本文所用，「剔除」包括以干擾目標多核苷酸序列之功能之方式刪除目標多核苷酸序列之全部或一部分。 舉例而言，剔除可藉由在目標多核苷酸序列之功能域(例如DNA結合域)中誘導目標多核苷酸序列中之插入或缺失而改變目標多核苷酸序列來達成。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
為了調查FVIII表現，在流體動力學注射方案中測試某些本發明之重組AAV FVIII構築體以量測其在活體內導致功能FVIII蛋白表現之能力。 如圖6中所示，在5μg質體劑量下測試之所有構築體以改變效率水準產生功能FVIII。 桿狀病毒為節肢動物之包封DNA病毒，其兩個成員為用於在細胞培養物中產生重組蛋白之熟知表現載體。
分子治療: 疫苗安全
A3域參與結合至血管假性血友病因子，但對於活體內功能活性FVIII可能非必需。 個體中之「出血事件」係指導致個體中之外部或內部出血之損傷，且一般包含損傷至形成血凝塊的時段。 在另一態樣中，本發明之重組AAV FVIII調配物可包含一或多種膨化劑。 例示性膨化劑包括(但不限於)甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、海藻糖及聚維酮。 在某些較佳實施例中，本發明之調配物包含甘露糖醇，其可以約5mg/ml至約40mg/ml，或約10mg/ml至約30mg/ml，或約15mg/ml至約25mg/ml之量存在。
分子治療: Taxes and tax credits
在一些實施例中，改變引起目標多核苷酸序列或其部分之剔除。 使用CRISPR/Cas系統剔除目標多核苷酸序列或其部分可適用於各種應用。 舉例而言，剔除細胞中之目標多核苷酸序列可出於研究目的活體外進行。
在一些實施例中，靶向多核苷酸序列為選自由B2M及CIITA組成之群組的一或多者。 在某些實施例中，細胞之基因體已經改變以減少或刪除HLA表現之關鍵組件。 細胞之電生理學可藉由使用熟習此項技術者已知之分析來評估。 舉例而言，全細胞膜片鉗及穿孔膜片鉗、用於偵測細胞之電生理活動之分析、用於量測細胞之動作電位之量值及持續時間之分析及用於偵測DA細胞之多巴胺產生之功能分析。 如本文所用，「安全港基因座」係指允許轉基因或外源基因之安全表現之基因座。 例示性「安全港」基因座包括CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(亦稱為AAVS1)基因、白蛋白基因、SHS231基因座、CLYBL基因及Rosa基因(例如ROSA26)。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
實驗評估了不存在CD47對巨噬細胞及小神經膠質細胞介導之殺滅的影響。 [圖8B]顯示對與異種(跨物種)人類巨噬細胞、人類小神經膠質細胞或小鼠小神經膠質細胞共培養之人類或小鼠dKO(B2M-/-CIITA-/-)細胞之影響，評估對巨噬細胞及小神經膠質細胞介導之殺滅的影響。 具體言之，人類小神經膠質細胞並未殺滅小鼠dKO細胞且小鼠小神經膠質細胞並未殺滅人類dKO細胞。
在另一實施例中，本發明提供增加有需要之個體之FVIII蛋白表現之方法，其包含向個體投予本發明之AAV載體中的任一者，或本發明之病毒粒子或由本發明之方法生產之病毒粒子。 在另一實施例中，本發明提供誘發有需要之個體之FVIII蛋白表現之方法，其包含向個體投予本發明之AAV載體中的任一者，或本發明之病毒粒子或由本發明之方法生產之病毒粒子。 「AAV病毒粒子(AAV virion/AAV viralparticle)」或「AAV載體粒子」或「AAV病毒」係指由至少一個AAV衣殼蛋白及如本文所述之衣殼化聚核苷酸AAV載體組成之病毒粒子。 若粒子包含異源聚核苷酸(亦即除野生型AAV基因組，如待傳遞至哺乳動物細胞之轉殖基因以外的聚核苷酸)，則其通常稱為「AAV載體粒子」或簡稱為「AAV載體」。 因此，AAV載體粒子之生產必定包括AAV載體之生產，因此載體內含於AAV載體粒子。 如請求項115至123中任一項之經分離神經細胞，其中該神經細胞在移植至患者之中樞神經系統中時展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
將iPSC(例如，野生型、B2m-/-Ciita-/- 、B2m-/-Ciita-/- CD47 tg或B2m-/-Ciita-/- CD24 tg iPSC)接種於LM511-E8塗佈之6孔盤上且維持於iPSC培養基中。 在細胞匯合之後，將維持培養基更換成包含補充有8% KSR、0.1 mM MEM非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉及0.1 mM 2-巰基乙醇之GMEM以及包括10 分子治療 nM LDN193189及500 nM A83091之添加劑的分化培養基。 自分化第1天至第7天，亦向分化培養基中添加2 µM嘌嗎啡胺及100 ng/ml FGF8。 自分化第2天至第12天，將細胞在補充有3 µM 分子治療 CHIR99021之分化培養基中培養。 在同種異體小鼠(7隻小鼠中有7隻)中，在不使用任何免疫抑制之情況下，低免疫EC移植物穩定存活度過19天隨訪(圖6)。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
一種神經細胞用於治療神經疾病之用途，其包含自幹細胞活體外分化之神經細胞，該神經細胞表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 在一些實施例中，Cas蛋白質可以編碼Cas蛋白質之核酸形式引入含有目標多核苷酸序列之細胞中。 適合技術包括磷酸鈣或脂質介導之轉染、電穿孔及使用病毒載體轉導或感染。